大家好，我是你们的科研好伙伴小V，上期我们为大家分享了“荧光定量PCR的常见异常结果”，应各位小伙伴们的需求，今天我们就来挖掘一下更深层次的异常问题。
除了之前谈到的扩增曲线异常、融解曲线异常两类常见情况外（可关注微信公众号：Vazyme-Biotech 回看），qPCR实验中通常还会遇到以下三大类情况：
复孔间重复性差怎么办？
复孔间重复性差一般会有以下两种情况：
（1）CT值很大，如CT≥30，重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的CT值差异较大。
解决 *** ：如果融解曲线没有杂峰，无模板阴性对照同目的基因的△CT值为3 or 5以上，那CT值为准确的，可多设置几个复孔，选择重复性好的CT值参与计算。
（2）CT＜30，重复性较差。这种情况一般同操作有关。
解决办法：从以下几个方面进行问题的排查：①加样准确度；②移液器吸取液体的准确度；③定期校准qPCR仪。
①加样准确度
✔.避免小体积加样，减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix、ddH2O配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，大体积加样。如：原液cDNA添加1μl，可以更改为原液cDNA稀释5倍，添加5μl，使用ddH2O补齐体系至20μl即可。
✔.SYBR Green Mix、配置的混合体系需要混合均匀。从-20℃冰箱拿出的试剂需要完全融化并上下颠倒彻底混匀；配置体系时，将混在一起的Mix用移液器吹打混匀。
②移液器吸取液体的准确度
✔.移液器量程定期校准，校准周期为1年。
✔.购买与移液器配套的枪头，若枪头与移液器不匹配，在吸取液体时易出现漏气的现象，导致吸取量程不准确。
✔.在吸取相同量程的液体体积时，注意观察每次吸取液体在枪头内的液面高度是否一致。
③定期校准qPCR仪
✔.一般qPCR仪校准周期为一年。
NTC（无模板阴性对照）出现CT值，目的基因的CT值还能使用吗？
NTC（无模板阴性对照）出现扩增一般会有两种情况：
（1）通过观察融解曲线，NTC与目的基因融解曲线峰形不重叠。一般NTC的Tm值较目的基因Tm值小。
这种情况下，NTC的CT值是由引物二聚体造成的，并不影响目的基因CT值的采集。
（2）NTC与目的基因融解曲线峰形重叠。NTC的Tm值等于目的基因的Tm值。
这种情况下，说明体系已被气溶胶污染了。那么，体系被污染，目的基因的CT值还能正常使用吗？
需要计算目的基因的CT值与NTC的CT值的差值（△CT）来判定。
若△CT≥5，说明气溶胶带来的污染对体系影响非常小，可以忽略不计。
如果达不到△CT≥5的程度，△CT≥3也可以认为气溶胶的污染程度很低，目的基因的CT值可正常使用。
若△CT＜3，说明污染已经很严重了，目的基因的CT值是不能使用的。
如何消除体系中的气溶胶污染呢？
①更换新的SYBR Green Mix、引物、模板。
②反应体系尽可能在超净台内操作，减少气溶胶污染。
超净台内台面需要定期使用稀释后的84消毒液进行擦拭，使用酒精棉球擦拭移液器，并使用紫外灯照射，以消除长期加样造成的核酸污染。
③严禁在加样房间打开qPCR产物的管盖。
✔补充：为何可以通过Tm值就可以判断是引物二聚体还是气溶胶污染呢？使用相同qPCR试剂进行扩增时，Tm值大小是由目的片段的产物长度与GC含量决定的，目的片段越长，GC含量越高，Tm值越大。
1、如果环境中被气溶胶污染，NTC产物长度与目的基因扩增的产物长度一致，Tm值一致，融解曲线峰形重合。
2、若NTC出现的扩增曲线是由引物二聚体造成的，其长度往往较短（一般引物二聚体的长度大约为50-60bp）,低于目的片段的长度（目的片段长度一般为80-200bp），所以引物二聚体的Tm值小于目的片段的Tm值，引物二聚体形成的融解曲线的峰形与目的基因的峰形不重叠。
CT值很大怎么办？
造成CT值偏大的因素较多，主要分为以下两大类情况：
（1）相同体系，前期实验CT值正常，本次实验，所有基因扩增CT值皆偏大。
这种情况下，需要排查RNA是否存在降解。如何判定RNA是否存在降解呢？可通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
完整度好的RNA是有三条带的，以真核生物为例，三条带分别是28s/18s/5s，且28s条带的亮度是18s的两倍，5s最暗（下图左）。如果RNA发生降解，会出现三条带的亮度发生变化，甚至不存在完整的三条带。如果28s几乎看不到了，整个泳道Smear严重，说明RNA的降解已经很严重了，此时RNA不建议用作后续的逆转录实验（下图右）。重新提取RNA重复实验。
如何避免RNA降解呢？
①如果您的样本是组织，取样的过程非常重要。组织内部是有内源性RNase存在的，组织离体后内源性RNase则开始发挥作用，RNA产生降解。所以离体的组织必须立马放在液氮中速冻，之后转移至-80℃长期保存，且避免反复冻融。研磨组织的过程中需要保证在液氮环境中研磨。RNA提取的过程中，保证样本的上样量不超过提取试剂盒说明书中规定的更大上样量，上样量过多，同样会造成RNA降解。
②如果您的样本是细胞，则样本搜集过程要简单的多了，只要保证细胞状态良好（细胞状态差也容易造成提取的RNA降解），样本上样量不超过提取试剂盒说明书规定的上限，一般提取的RNA质量都是很好的。
③除此之外，提取的过程中戴一次性干净手套；在单独洁净的区域操作；戴口罩并在操作过程中避免讲话。可有效防止实验者汗液、唾液中的RNase污染。
（2）该基因之一次扩增，其CT值偏大，而其余基因的CT值正常。
这种情况下就需要判定是因为基因的扩增效率低导致的CT值偏大，还是基因本身的表达量低造成的CT值偏大。
如何判定是因为基因的扩增效率低导致的CT值偏大，还是基因本身的表达量低造成的CT值偏大呢？首先需要计算引物的扩增效率。
可将基因的扩增产物进行梯度稀释（至少三个梯度，且梯度之间的△CT均一，防止因为操作原因导致标准曲线线性关系差，进而影响扩增效率的计算），同时进行qPCR。将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算：
以Vazyme #Q711的荧光定量Mix扩增某基因为例：
①qPCR扩增：
将qPCR产物进行原液、1/10、1/100梯度稀释，每个梯度设置三个复孔，进行qPCR扩增，复孔间CT值取平均值，得到三组CT值。
②标准曲线绘制及扩增效率计算：
可以在excel上进行扩增效率的计算。稀释梯度可以设置为-1/-2/-3，每个梯度对应的CT值分别为23.69/27.04/30.27，如下图，进行标准曲线绘制。通过标准曲线可以得到线性方程（y = -3.29 x + 20.42）与R2值（R2 = 0.9999）。将线性方程得到的斜率（-3.29）带入扩增效率计算公式中：
，即可得到扩增效率。本基因使用Vazyme #Q711扩增效率为101.35%。
只有当扩增效率满足90-120%，且标准曲线R2≥0.99，引物的扩增效率才是合格的，定量出来的CT值才可以用来计算。且扩增效率越接近100%，引物的扩增性能越优。
1、若扩增效率不满足90-120%，那CT值偏大是因为扩增效率不达标导致的，需要重新设计引物。
2、若引物的扩增效率满足90-120%前提下，CT值仍然很大，则是基因本身表达量低造成的CT值偏大，可以提高模板的添加量，但最根本的 *** 是改为探针法进行定量。探针法的灵敏度是高于染料法的。
今天的课堂小知识就讲到这里，关于qPCR实验中的常见问题，你都了解了吗？有任何疑问，欢迎咨询您身边的诺唯赞人，我们将不懈努力，为您提供更优质的产品和服务！
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